MTT(四唑盐)比色法

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标签: 细胞活力测定 比色法 MTT 四唑盐

四唑盐(MTT)比色法可以:(1)检测细胞存活和生长;(2)大规模的抗肿瘤药物筛选;(3)细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定;(4)生物活性因子的活性检测。

实验方法原理

MTT法是Mosmann 1983年报道的,以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

实验材料

细胞样品

试剂、试剂盒

PBS DMSO 胰蛋白酶 甘氨酸缓冲液 二甲亚枫

仪器、耗材

加样器 96孔培养板 酶标仪 培养板

实验步骤


一、实验前应明确的问题
1.  选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2.  药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3.  时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
4.  培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68 h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48 h换液的。
5.  MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.  理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.  实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
8.  避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

二、贴壁细胞
1.  收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100 ul,铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2.  5% CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100 ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。
3.  5% CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4.  每孔加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4 h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5.  终止培养,小心吸去孔内培养液。
6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.  同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
三、悬浮细胞
1.  收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将

(1)补足的1640(无血清)培养基40 ul ;

(2)加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培养液稀释 (储存液100 ug/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);

(3)需检测物10 ul;

(4)细胞悬液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100 ul 1640)。
2.  置37℃,5% CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3.  每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)
4.  离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
5.  同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
四、MTT的配制
MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
1.  PBS配方
(1)NaCl :8 g。
(2)KCl 0.2:g。
(3)Na2HPO4 :1.44 g。
(4)KH2PO4:0.24 g。
(5)调pH7.4。
(6)定容1 L。
五、细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100 ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。

注意事项


1.  选择适当得细胞接种浓度。
2.  避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3.  设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!
举个例子:
各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
参考公式:
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm: 最大阳性反应率
Pn: 最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例:
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200 ul 1640,20 u lMTT,150 ul DMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定,一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20 ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150 ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。


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