培养细胞的形态观察和计数实验-指示剂法

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标签: 细胞 形态观察 计数

本实验目的是了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态,同时可以掌握细胞计数的基本方法。

实验方法原理

体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞,如HeLa 细胞、NIH3T3 等,叫贴壁型细胞,体外培养的细胞大多属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上,而是悬浮在培养液中生长,如HL60 细胞,叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性细胞。在细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验不可缺少的一种基本技能。

实验材料

HeLa细胞 NIH3T3 HL60 细胞

试剂、试剂盒

台盼兰染液 胰蛋白酶 EDTA 混合消化液

仪器、耗材

倒置显微镜 细胞计数板 普通光学显微镜 3ml巴士吸管 盖玻片

实验步骤

一、培养细胞形态观察

1.  将细胞培养瓶从37 ℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出,瓶口稍稍向上 倾斜以免瓶内液体接触瓶塞或流出瓶口,注意观察细胞培养液的颜色和清 澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。

2.  打开倒置镜光源,用10X 物镜观察,通过双筒目镜将视野调到合适的亮 度,并调节双目镜的光瞳间距,使左右两个视场象合而为一。

3.  调节载物台高度进行对焦,在看到细胞层之后,用细调节器将物像调清 楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时,经常使用的是十 倍的物镜。

4.  结果
贴壁细胞一般有两种形态,即上皮细胞型和成纤维细胞型细胞。上皮细 胞型细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连 接成单层细胞片,如HeLa 细胞。成纤维细胞型细胞形态与体内成纤维细 胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质向外伸 出2~3 个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,细胞生长时多 呈放射状或漩涡状,如NIH3T3。
贴壁细胞在生长状态良好时,细胞均质而透明,细胞内颗粒少,看不 到空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液清澈 透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多,细胞轮廓增强反差较大时, 表明细胞机能状态不良,生长较差。当培养瓶内培养基混浊时,应想到细 菌真菌污染的可能。悬浮细胞边缘,透明发亮时,生长较好;反之,则较 差或已死亡。由于培养基内有PH 指示剂的存在,因此它的颜色往往可以 间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好;呈淡 黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多;如呈紫红色, 则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。实际上一种细胞在培养中的形态 并不是永恒不变的,它随营养、PH、生长周期而改变,但在比较稳定的条 件下形态是基本一致的。在贴壁细胞的培养中,镜下折光率高,圆而发亮 的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。

二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定
1.  准备计数板
用95%酒精棉球擦干净计数板,把盖片覆在计数板上面。
2.  制备细胞悬液
将培养瓶中的培养液倒入干净试管中,向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液1 ml,静置3~5 分钟,待见到细胞变圆, 彼此不连接为止。将试管中的培养液倒回培养瓶中,并轻轻进行吹打, 制成细胞悬液。
3.  染色
取细胞悬液0.5 ml,加入0.3%台盼兰染液0.5 ml,混合后染色3~5 分钟。
4.  滴加悬液
将悬液摇匀后,沿盖片边缘缓缓滴加少许已染色的细胞悬液于细胞计数 板的斜面上,使液体自然充满整个计数室。小室内有气泡或液体过多使盖 片漂移时,要重新滴加。
5.  计数
在普通光学显微镜10X 物镜下计数四个大格内的细胞数,压线者数上不 数下,数左不数右。
6.  结果
按下式进行细胞浓度的计算:
大格中细胞总数×104①×稀释倍数=细胞数/ml 悬液
大格中细胞总数-染色细胞数×104②稀释倍数=活细胞数/ml 悬液
注①由于四大格中每一大格体积为0.1 mm3,1 ml=10,000 大格,因此,1 大格细胞数×10 4 =细胞数/ml。
注②染色标本在15 分钟内计数,因为台盼兰染液可使死细胞迅速染色,拖 延计数时间活细胞也被着色。

进行细胞计数时应力求准确,因此,在科研中,往往将计数板两侧都 加上细胞悬液,并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板数次),最 后取计数的平均值。

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