石蜡切片免疫组化实验-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC法)

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实验材料 

蜡块切片

试剂、试剂盒

多聚甲醛 蒸馏水 蔗糖 过氧化氢 甲醇 PBS 酒精 KPBS 牛血清白蛋白 叠氮纳 一抗 二抗

仪器、耗材

冰箱 显微镜 烧杯
实验步骤

1.  4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片,贴片。0.01 M KPBS清洗5 min×3后;
2.  加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%过氧化氢)30 min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01 M  PBS清洗5 min×3;
3.  加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100+0.01 M  KPBS 100 ml)30 min,以增加细胞的通透性,0.01 M KPBS清洗5 min×3;
4.  加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00 g+0.01 M PBS 100 ml+叠氮纳0.08 g)稀释的一抗,4℃存放24-48 h;吸去抗体,0.01 M KPBS洗5 min×3;
5.  加入0.01 M KPBS稀释的的二抗,室温孵育2 h。0.01 M KPBS洗5 min×3;
6.  加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2 h,0.01 M KPBS洗5 min×3;蒸馏水迅速冲三次;
7.  加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30 min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01 M KPBS终止反应;
8.  梯度酒精脱水之后,封片,拍照。


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