石蜡切片免疫组化实验-即用型(Envision)快速酶免疫组化二步法

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实验方法原理

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后,加入底物显色。

实验材料

石蜡切

试剂、试剂盒

PBS 柠檬酸盐缓冲液 蒸馏水 增强剂 酶标抗鼠 兔聚合物 苏木素 酒精 二甲苯 树胶 盐酸 二氨基联苯胺
仪器、耗材

烘箱 微波盒 塑料切片架 显微镜 胶头滴管

实验步骤

1.  石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。
2.  取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)
3.  每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。
4.  除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。
5.  PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂,室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。
6.  除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。
7.  除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5分钟。
8.  苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

其他

一、特点
1.  在切片加上一抗后,第二抗体标记多聚螯合物酶(HRP)的复合物与一抗结合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信号有显著的放大,其敏感性较SABC、SP法高。
2.  由于多聚物在体内不存在,又不使用生物素,从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。
3.  辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上,替代传统方法的 二抗、三抗,减少了实验步骤,且试剂孵育时间短,只需15分钟,使得免疫组化方法更简单,实验时间比SABC、SP法大为缩短。


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