MTT检测细胞活性的操作方法

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一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么
简单地说:是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途
1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;
2.细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。
四、实验所需材料
1.MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g
1.1对于100mg这样的小包装,厂家都是将MTT放入小管中的,个人建议不要再用天平称量分装,而应该一次性将其全配制成溶液,如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法:预先在50ml离心管(没有的话,可用培养瓶替代)加入20ml PBS,从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中,吹打若干次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。可以重复几次,以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算,一般每96孔板约需1ml,所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2对于大包装,可按上述方法称取一部分溶解,也有人将粉剂分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加。
注意事项:
1. 在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感
MTT一般最好现用现配,过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液,效果仍然不错)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.
2.MTT甲瓒溶解液
2.1二甲基亚砜DMSO,可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。
2.2三联溶解液:SDS10g,异丁醇5ml,10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液,该溶解液不需去除原培养基,但溶解较慢。
该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤
1.胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
对于初学者而言,要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手,我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的625px2为例,
1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态),消化离心收集后,将上清去掉,加入3ml培养基使其混匀。
2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用),装入约9ml培养基.
3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管,混匀后细胞计数,此时一般为或小于5-10×104/ml,该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度,再根据计数的结果滴加细胞悬液,每滴按50ul计算。
4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整,如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml),细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。
2.将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加6个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于MTT的结果至关重要。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个,否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。
对于加药,有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中,以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好,然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基,这样能保证药物浓度的准确。另外,需注意的是,如果用这种方法,不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药,应该吸完一部分后立即加样,避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
6. 终止培养,准备溶解结晶。
溶解结晶的方法有两种,第一种,用DMSO溶解
1) MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。将上清去掉,该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走,也有人建议先铺几张滤纸在桌面,然后将96孔板轻轻倒置,这样上清便被滤纸吸走,以减少结果的损失。个人认为,这两种方法都有可能导致结晶的损失,从而引起结果的不准确。采用哪种方法,可以自己摸索一下再决定。
2) 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
另一种方法,用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)
1) MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。)
2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时,镜下观察,待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。
在实际的操作过程中,往往为了等待4—6小时,使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值,给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索,加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响,但要注意的是一定要避光,不过培养箱关闭后本身就是闭光的,所以加入溶解液后放入培养箱中,第二天上班时再测OD值就可以了。
7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
六、MTT结果分析
关于如何计算IC50
1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
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