细胞原代培养实验-胰酶消化法

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  细胞原代培养可以:(1)为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段;(2)为传代培养创造条件;(3)服务于临床实践,用于药物筛选等。

实验方法原理

将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。因此,较为严格地说是指成功传代之前的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留二倍体数。但实际上,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

实验材料

胎鼠 新生鼠

试剂、试剂盒

1640培养基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒

仪器、耗材

培养箱 培养瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 纱布 手术器械 血球计数板 离心机 水浴箱

实验步骤


一、实验材料准备
1.  Hank’s液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
二、具体操作
1.  将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
2.  用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
3.  用手术剪将肝脏剪成小块(1 mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
4.  视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5.  加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6.  静置5-10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
7.  1 000 rpm,离心10分钟,弃上清液。
8.  加入Hank’s液5 ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
9.  加入培养液1-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
10.  将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25 ml细胞培养瓶中,37℃下培养。

注意事项


1.  自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2.  在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。
3.  凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。
4.  操作前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
5.  点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。
6.  操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。
7.  不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。
8.  瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9.  吸溶液的吸管等不能混用。
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