Transwell侵袭实验集锦

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transwell

这里想明确两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell
关于Transwell这个词该如何解释,查了很多资料也未见准确的注解,我觉得可以这么理解吧,trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上理解,这是一类有通透性的杯状的装置,根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍,可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters),也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports)。
更准确地说,Transwell应该是一种实验技术,这项技术的主要材料是Transwell小室(Transwell chamber,Transwell insert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不同厂家对Transwell会有不同的命名,而不同型号也可有不同形状,不同大小,根据实验需要,可有不同选择。

但无论是何种外形,其关键部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔,孔径大小有0.1-12.0?m,根据不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。

将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不同细胞其体积不同,具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验:
(1).共培养体系:
小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0?m以下孔径。常用0.4、3.0?m。我们实验室用的是0.4?m。

将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
(2).趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0?m膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
(3).肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0?m膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4).肿瘤细胞侵袭实验
常用8.0、12.0?m膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

以上是Transwell的一些常见的应用

1.实验用品:
① Transwell小室:

多种厂家可提供,论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很方便,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是非常贵,24孔板配套的小室,每个价格约130元,不推荐给大家。BD也有已包被好的,价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室,是论坛里比较常用的,好像是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有40左右,应该比较适合中国国情。
下面是一些战友提供的价格,具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8?m,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格:Millipore的8?m的50个1760RMB,0.4?m的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格: 240RMB一块(6.5um,24孔,12instert),好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。平均每个20元不到。
Transwell小室按照公司的要求,都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很干净,用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2。
因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以反复用很多次,但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能重复用一次,真黑啊!很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的,大家可以试试。
本人没见过,有兴趣的可以自己研究一下。
另外,根据论坛战友提供的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理。Transwell小室用过后,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法: trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余的边缘。再照紫外。
② 上层培养液:
上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。
③ 细胞:
值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目,还是小心为妙。
另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。
④ 基质胶:
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的:Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格:BD公司的matrigel 1500左右。
如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。
⑤ 下层培养液:
下层常用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS仍是最合适的。
⑥ 细胞培养板:
常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。很多战友认为这不是必须的,而且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为,如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好还是在膜下层涂上FN。
另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
zhangyong1036战友提供的价格: sigma的fibronectin,价格在1500左右。

1.  无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜:
用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0.5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜:
吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul)60-80 ?l (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶


Transwell的其他应用的实验步骤

1.Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为,由于没有基质胶的阻挡,细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快,所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁移实验的密度是1×106。另外,下层培养液的FBS浓度也可适当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁移实验的浓度是2.5%。
2.Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友共同探讨:
(1). 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)、无Ca 2+、Mg2+,无血清的MEM。
(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。
(4). 冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12 mm SNAPWELL, Costar),以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
3. Transwell B16细胞的体外迁移实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验,具体是这么做的:首先把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜(0.8 um)的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内,后在Transwell的内室加入细胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度),放入培养箱,12-18小时后,取出Transwell,用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下观察细胞,记数。
4.内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后,上室加入100?l用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物,下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照,置于CO2培养箱中作用8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照,最后用10%乙酸100?l/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为:抑制率(%)=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/(OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.

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