细胞污染的思考和自己的体会

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细胞污染的思考

本人最近老遭到细胞的污染,前期的实验都在这一关被卡住,很是郁闷,需要追其原因,避免再次发生,由此小结了一下细胞培养过程中的一点经验教训,希望成为大家的前车之鉴。

细胞污染严重性:

污染是细胞培养技术中面临的主要问题。由每一种细胞有其独特的培养体系,因此污染造成后果也不尽相同。某些污染的发生(特别是支原体和少部分的真菌)往往难以察觉检测,而且污染源能长期共存于培养体系中,在实验前期容易被忽视。培养的细胞作为个生物体,会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应,造成培养细胞生物学特性的改变,而实验结果造成潜在的威胁,而且随着污染时间的长而增加。培养环境中的物理、化学及生物因素都可能入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养系中不断增殖、代谢,因此生物性的污染对细胞的害最大。随着污染微生物的不断增殖,交叉污染可能性也不断增加。此外,微生物代谢消耗大量需的养分,同时产生多种有毒的代谢产物,如酶、抗原及毒素等,进一步对细胞产生毒害作用。因此,认识细胞培养污染的途径及其危害性,建立细胞培规范的操作方法及规章制度,可以有效地防止污染保证实验体系的稳定性和可靠性。

细胞污染的类型

一、细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。

培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变而呈现黄色。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。一般细菌污染进程很快,大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。

二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间(发生卵圆形物体污染的几率很大)。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

三、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。

四、病毒污染

采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

五、非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的,而现在却认为是HeLa细胞。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。

非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

污染来源及鉴别

一、污染来源

细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径:

1、不洁的动物组织标本

很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外),但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌,如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡,也会带菌,造成细胞污染。

2、空气

空气中含有大量的微生物,如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,净化工作台使用过久,滤板未定期更换或长久不更换,滤气受尘埃堵塞,工作时不带口罩或外界气流过强,污染空气进入操作区,也会导致污染。春夏季南方地区多雨,空气湿度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。

3、清洗消毒

培养用物品、材料洗刷不净,培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。

4、操作

来自操作者的污染主要有以下几方面:

(1) 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过,或者是否已经消毒灭菌处理过,或者虽经处理,时隔已久又末重新处理。

(2) 操作者未戴口罩、帽子,呼出气中排出细菌和支原体。

(3) 培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。

(4) 操作者不当心,动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品,如手上皮肤和瓶子外壁等。

(5) 细胞倾液时倒出培养瓶或者滴落在超净台上,未及时擦净或者灼烧。

(6) 灼烧的火不够旺。

(7) 移液管吸取液体时将空气中的气流吸入培养瓶中。

(8) 长时间的将离心管放在离心机中,可能由于口没有完全封闭而造成污染。

(9) 同一根吸管或者放置吸管的离心管长时间使用造成的一管污染多瓶细胞交叉污染。

(10) 操作者操作时大声说话,来回走动扬起灰尘等。

5、血清

市售血清灭菌不彻底,潜在病毒和支原体污染。

二、污染的鉴别

1、细菌、真菌污染的检测

(1)肉眼观察  细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。

(2)镜下观察  在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

(3)接种观察  采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染。

2、支原体污染的检测

(1)相差显微镜观察  将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

(2)荧光染色法观察  用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,然后用荧光显微镜观察。染色方法为:用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上,在细胞汇合前(即未长满前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗,1:3醋酸钾固定10分钟,再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟,置于蒸馏水漂洗1~2分钟,向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液,然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液,先离心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟,再用生理盐水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258,DAPI或者PI等核染色试剂,染色10分钟,加入蒸馏水漂洗,离心去上清蒸馏水,加3~5滴pH5.5磷酸缓冲液,稍吹打使沉淀细胞重悬浮,用吸管吸出,滴于载物片上,盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。

(4)电镜检测 可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48~72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。

(5)培养检测  将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基(Sigma或北京生物制品所生产的均可),培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀,然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中,再用琼脂培养基做分离培养,37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

* 培养加荧光核染色是检测支原体污染的黄金搭档。

污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。在超净台中进行细胞培养时,特别注意在进行移液,倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生,飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生,应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用,如胰酶、培养液等。否则,一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。

一般预防可从以下几方面着手:

一.无菌操作基本技术

1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以5% 新洁尔灭擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以5% 新洁尔灭擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以5% 新洁尔灭擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目:

5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力

5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。

要特别注意的几点:

1、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用,并且需要尽快使用,特别注意容易染菌的液体如培养基,琼脂糖,血清等需要在低温保存,减少染菌的几率。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。。

2、从操作者做起

(1)操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。在制定好实验步骤后,头脑清醒的进无菌室进行实验。 备好一切所需要的试剂和培养瓶,防止在操作过程中来回跑动寻找,增加染菌的几率。在实验前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用5%新洁尔灭擦手、擦带进的培养基瓶壁,和无菌操作台。严格遵守无菌操作规则。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。尽量减少在超净台中物品的放置,特别注意不能将物品放置在流通空气的虑孔上,以免降低整个超净台的工作效率。

(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼,注意火苗要旺盛,如果酒精灯中的酒精用尽要及时补充。要尽量使用侵斜试剂瓶45°的管架,减少垂直放置培养瓶造成染菌的机会。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

(3)操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

(4)操作过程中头脑清醒,动作敏捷果断,打开的培养瓶和瓶口应远离操作者手势范围,避免影响垂直的空气流将操作者身上的病菌带到培养细胞中。废液钢尽量避免使用敞口的容器,倾倒时要抬高一点,防止在倾倒废液时溅起的液体污染瓶口。

(5)防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。

细胞培养小技巧

一.实验用品
1. 实验用品种类︰

1.1. 细胞培养实验用品均为无菌,除了玻璃容器与pasteur pipet 外,其它均为塑料无菌制品。

1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附,培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依实验需要使用。

1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml

1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml,均有2 种不同材质,其中polypropylene (PP) 为不透明材质,polystyrene (PS) 为透明材质,可依实验需要而选择适合材质之离心管。

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。

1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml

6 \- T$ D! |! ~2. 清洗︰

2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1-0.05 N HCl 浸泡数小时,洗净后才开始使用。

2.2. 用过之玻璃血清瓶,以高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。

3. 灭菌︰

3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟,置于oven 中烘干。

3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。

3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。

1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱,避免光照,实验进行前放在37℃ 水槽中温热。 0 S'、

2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月,期间glutamine 可能会分解,若细胞生长不佳可以再添加适量.

3. 粉末培养基配制(以1 升为例):

3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清,因此粉末培养基之配制体积为900 ml,pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加,若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2 气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH 易发生改变。

3.2. 材料: 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水,水品质非常重要),粉末培养基,NaHCO3电磁搅拌器,无菌血清瓶,0.1 或0.2 mm无菌过滤膜,pH 计,真空泵,CO2 气体。

4.步骤:

3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解。

3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解,然后通入CO2 气体至饱和,约3-5 分钟。

3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否则不需用酸碱再调整之。若为太碱,可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,pH 会升高0.1-0.2。

3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

三三抗生素

1. 细胞库的细胞培养基不加抗生素

1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株,培养基中不加抗生素。

1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。

2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask 时,则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素100 ug/ml)。

3. 若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加庆大霉素,因庆大霉素会抑制支原体生长。

4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: 青霉素 250 units/ml, 链霉素 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, 杆菌肽 2.5 units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。

四.血清

1. 血清必须贮存于–20 ~ -70℃,若存放于4℃,请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶,可将40~45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %, 必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2. 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。

3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般以50 ml 无菌离心管可分装40~45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须,一般不建议作此热处理,因为会造成沈淀物之显著增多,且会影响血清之品质。补体受到破坏。

5. 勿将血清置于37℃太久,若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。

6. 血清之沈淀物

6.1. 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。 生物6.2. 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“,但在37℃环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。

五.细胞传代培养

1. 细胞生长至高密度时,即须分至新的培养瓶中,一般稀释比例为1:3 至1:6,依细胞种类而异。

2. 材料:

2.1. 胰酶溶液(0.05% 胰酶): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃ 水槽回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 生物论坛,生3. 步骤:

3.1. 附着型细胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉旧培养液。

3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。

3.1.3. 加入胰酶溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 ℃作用数分钟,于倒立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉或者倾倒胰酶溶液。(若没有完全去除,则在胰酶作用后,加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用)

3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。

3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5-10分钟。

3.2.2. 吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。

3.3.杂交瘤细胞

有些杂交瘤需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分至新培养瓶中。

六.细胞冷冻保存

1. 注意事项:

1.1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好的指数生长期且高存活率,约为80-90%的汇合度。

1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色。4℃避光保存,勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4. 冷冻保存之细胞浓度

1.4.1. 正常人成纤维细胞: 1-3×106 cells/ml

1.4.2. 杂交瘤细胞: 1-3 x 106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些杂交瘤细胞会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。

1.4.3.贴壁的肿瘤细胞系: 5-7 x 106 cells/ml,依细胞种类而异。腺癌解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3×106cells/ml。

1.4.4.其他悬浮细胞: 5-10× 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5×106cells/ml。 1.5. 冷冻保护剂浓度为5% 或10% DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个对照培养,以防止冷冻失败。+ n6

2.细胞冷冻保存的具体操作

2. 材料:

2.1. 生长良好之培养细胞

2.2. 新鲜培养基

2.3. DMSO (Sigma D-2650)

2.4. 无菌塑料冷冻保存管

2.5. 0.4 % w/v 台盼蓝

2.6. 血球计数盘与盖玻片

2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)

3. 步骤:

3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。

3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,混合均匀,置于室温下待用。

3.3. 依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约20ul) 计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4. 离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,对应细胞适合的冻存密度混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 ml/管,并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5. 冷冻保存方法:在每一个冻存管上注明细胞系的名字,冻存者姓名和冻存时间,方便日后寻找。将一批细胞用橡皮筋捆绑住,用足够多的棉花将冻存管包裹,包括烧杯的底座和瓶顶,保护细胞逐级冷却,防止过快冷冻产生的冰晶破坏细胞状态,放入-80℃冷冻,然后放置于液氮中。

七.冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞的活化原则为快速解冻,避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害,导致细胞死亡。

2. 细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3. 材料 37℃ 恒温水,新鲜培养基,无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶,液氮或干冰容ww.bbioo

4. 步骤:

4.1 操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。

4.4 取出冷冻管,立即放入37 °C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化以70 % ethanol 擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。

4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10~1:15)混合均匀,放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。

4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol),依细胞种类而异,一般而言大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内,离心1,000 rpm, 5 分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2 培养箱培养。

4.7 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。


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